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标题：In Silico Study of Ionizable Lipid Nanoparticles Using the SPICAForce Field

期刊：J. Chem. Theory Comput.

网址：https://doi.org/10.1021/acs.jctc.5c00498

一、文章摘要

脂质纳米颗粒（LNPs）由可离子化的氨基脂质、磷脂酰胆碱（PC）脂质和胆固醇组成，已被证明在多种应用中（包括癌症免疫疗法、细胞重编程、基因编辑和病毒疫苗，例如针对 COVID-19疫苗）作为治疗性寡核苷酸的传递载体具有良好的前景。然而，关于可离子化的氨基脂质及其组装体（如 LNPs）的分子表征（包括在计算机模拟和体外实验中）仍处于早期阶段。特别是，由于需要精确的粗粒度（CG）模型，关于 LNPs 的计算机模拟研究以了解其纳米结构一直较为有限。在本研究中，我们扩展了 SPICA力场，以开发一个更可靠和更准确的显式粗粒度模型，用于通过计算机模拟实验研究模型 LNPs 的结构和性质。使用这个粗粒度模型，我们对具有不同辅助脂质和 pH条件的 LNP系统进行了分子动力学模拟。我们的结果表明，在 pH4时，LNPs 中的双链 DNA（dsDNA）夹在紧密接触的单层之间形成了双层结构；而在 pH7时，dsDNA 分子则嵌入到 LNPs内部的无定形区域中。这些通过计算机模拟优化的微结构与从小角度 X射线散射和低温透射电子显微镜（低温 TEM）获得的实验观察结果高度吻合。此外，对含有不同辅助脂质的脂质纳米颗粒（LNPs）的详细分析解释了为何用不饱和 PC脂质取代饱和 PC脂质会提高 DNA转染活性。总体而言，这项研究为 LNPs 的计算机模拟研究提供了可靠的 CG模型，并提供了深入的分子层面见解，以改进其设计以提高稳定性和有效性。

二、计算图文

图 1.（a）未带电的 MC3 的 CG 分子模型以及（b）带正电的 MC3 的 CG 分子模型。透明的椭圆形框表示由单个 CG段所代表的原子群。

图 2.（a）阳离子型 MC3、胆固醇（CHOL）和双链 DNA 的初始配置，用水进行少量润湿处理。 （b）经过约400 纳秒的 CG模拟后系统的快照。 （c）加入磷脂（PC）并施加球形壁电位后的悬浮水中的球形脂质纳米粒。颜色方案：阳离子型 MC3为青色，胆固醇为绿色，DOPC/DSPC为紫色，双链 DNA为黄色。水用半透明的冰蓝色表示。

图3. （a）中性 MC3 和 （b）阳离子 MC3 在缓冲水相下表面压力（π）与分子面积（A）的关系曲线。黑色实线代表实验所得的 π - A曲线，而红色线则表示通过优化参数进行 CG MD模拟得到的 π - A曲线。

图 4 。选取的 CG片段在阳离子 MC3/DOPC二元单层表面的密度分布情况，分别对应于（a）阳离子 MC3脂质和（b）DOPC 的情况。实线表示 CG模拟的结果，而虚线则表示 AA模拟的结果。

图 5.（a）基于阳离子 MC3 的 LNPs与 DSPC 在水溶液中进行的 CG MD模拟的时间演化过程。LNPs 的横截面视图展示了基于阳离子 MC3 的 LNPs 中各成分的排列情况，在（b）小长度尺度和（c）大长度尺度下均有展示。颜色方案：阳离子 MC3脂质为青色，胆固醇为绿色，DSPC为紫色，dsDNA为黄色。为清晰起见，水和离子未绘制在图中。

图6.以阳离子型 MC3/DSPClipid为基础的脂质纳米粒在纳米粒表面法线方向上脂质的分布情况，从纳米粒表面（r =0纳米）到纳米粒内部。颜色方案：阳离子型 MC3为黑色，DSPC为红色，胆固醇为绿色。插图：带有表面平均疏水面积（SASA）的纳米粒横截面视图。颜色方案与图2相同。

图7. 在水溶液中，基于中性 MC3 的脂质纳米颗粒在（a）小尺度和（b）大尺度下的横截面视图。颜色方案：中性 MC3脂质为青色，胆固醇为绿色，DNA为黄色，DSPC为紫色。为清晰起见，水和离子已省略。

图 8 。比较了（a）MC3脂质和（b）胆固醇在阳离子型和中性型 MC3脂质包被的脂质纳米粒（pH4 对比 pH7）表面法线方向上的概率分布情况，该分布是从脂质纳米粒表面（r =0纳米）沿其各自的中心方向进行测量的。

图 9.基于 MC3 的 LNPs 在 DOPC存在下的横截面视图，在水溶液中分别于（a）pH4 和（b）7时呈现。颜色方案：蓝色表示带电或中性的 MC3脂质，绿色表示胆固醇，黄色表示 DNA，紫色表示 DSPC。为清晰起见，水和离子未画出。

图10.含有 DOPC 和 DSPC 的脂质纳米粒表面脂质的百分比（a）在 pH约为4 的条件下，（b）在 pH约为7 的条件下；以及脂质纳米粒内部围绕 dsDNA 分子的最近邻脂质的百分比（c）在 pH约为4 的条件下，（d）在 pH约为7 的条件下。每个脂质类型的百分比均根据系统中脂质类型的总数重新计算得出。

图11. RDF 图显示了（a）PClipids 在 CHOL周围的质心分布情况，（b）中性 MC3脂质在 CHOL周围的分布情况，以及（c）中性 MC3脂质在 PC周围的分布情况。颜色方案表示含有 DOPC脂质的 LNP（黑色）和含有 DSPC脂质的 LNP（红色）。

三、计算分析

3.1. 模拟计算分析的主要内容

文章通过CG MD模拟，聚焦于LNPs的分子级结构、动力学行为和功能机制。具体分析内容如下：

3.1.1 LNPs纳米结构的pH依赖性演化

模拟揭示了LNPs在酸性（pH ~4）和生理（pH ~7）条件下的结构差异，关键发现包括：

pH ~4（模拟内体条件）：LNPs形成双层结构（bilayer），双链DNA（dsDNA）被夹在带正电的脂质双层之间（图5b）。这种结构源于可电离脂质（如MC3）的质子化，促进静电相互作用，导致DNA与脂质的紧密结合。模拟显示，双层厚度约为4.5 nm，与实验cryo-TEM数据一致。

pH ~7（生理条件）：LNPs转变为非晶态水域结构（amorphous water domains），DNA嵌入颗粒内部的水域中（图7）。由于MC3脂质中性化，静电吸引力减弱，导致DNA分布松散，部分区域出现泄漏（尤其在小尺寸LNPs中）。这解释了LNPs在储存中的不稳定性。

3.1.2 辅助脂质（Helper Lipids）的影响机制

文章分析了饱和脂质（DSPC）与不饱和脂质（DOPC）对LNPs性能的影响：

结构差异：DOPC基LNPs的表面覆盖较差（DOPC仅占表面脂质的4.7% vs. DSPC的4.0%），导致颗粒更松散（半径回转Rg较大），而DSPC基LNPs的胆固醇（CHOL）分布更均匀（图10）。这与实验观察到的DOPC基LNPs具有更高转染活性但稳定性较低的现象一致。

分子相互作用：通过径向分布函数（RDF）分析，DSPC与CHOL的相互作用更强（RDF峰值更高），而DOPC则较弱，导致DOPC基LNPs内胆固醇溶解性差，引发结构不稳定（图11a）。

3.1.3 DNA-脂质复合物的自组装行为

模拟追踪了DNA与脂质的动态结合过程：

自组装机制：在有限水条件下，阳离子MC3脂质通过静电作用驱动DNA形成层状结构（图S6）。CG模型成功复现了全原子（AA）MD观察到的自组装模式，DNA被夹在脂质双分子层之间，半径回转（Rg）误差小于0.4 Å（表S5）。

DNA分布：概率分布分析显示，在pH ~4时，DNA靠近LNP表面（r = 0–8 nm），而在pH ~7时，分布更广泛（r = 3–18 nm），证实了DNA在内部水域的嵌入（图S9）。

3.1.4 脂质分布与表面组成

通过概率分布和组分分析，量化了LNPs内脂质的空间分布：

表面vs.内部脂质：在pH ~4时，小LNPs表面脂质占比22%（大LNPs为16%），而内部以MC3和CHOL为主（图6）。水体积分数为21–24%，与实验数据吻合。

核心结构：中性MC3脂质在pH ~7时优先定位到LNP核心（图8a），形成类固态结构，支持了实验中“中性脂质促进核心形成”的假说。

四、计算方法

本文通过分子动力学模拟研究可电离脂质纳米颗粒（LNPs），其计算体系包含全原子（AA）模拟和粗粒度（CG）模拟两个层次，核心是扩展SPICA力场（SPICA FF）并优化参数。以下从科研角度详细拆解计算方法和参数体系，结构分为四部分：
1. 力场模型与能量函数
2. 参数优化策略
3. 模拟系统构建
4. 关键分析指标

4.1. 力场模型与能量函数

4.1.1 SPICA力场扩展

文章扩展了SPICA力场以支持LNPs组分，新增三种CG粒子类型：

NC2（中性MC3头基：-CH₂-CH₂-N(CH₃)-CH₃）

NC3（质子化MC3头基：-CH₂-CH₂-NH⁺(CH₃)-CH₃）

CM1（连接基团：-CH₂-CH-CH₂-）
其他组分沿用SPICA原有粒子（如EST1、CM、CMD等），具体定义见表1：

表1：CG粒子类型定义（原文Table 1）

4.1.2 能量函数形式

总势能 Utotal 包含键合项 (Uintra) 和非键项 (Unonbond)：

键合项（键长、键角、二面角）：

Uintra=bond∑k_b(r−r₀)²+angle∑k_θ(θ−θ₀)²+dihedrals∑k_φ[1+cos(nφ−δ)]

其中 k_b,k_θ,k_φ 为力常数，r₀,θ₀ 为平衡值（通过AA MD拟合）。

特殊校正：为避免过度弯曲，引入1-3相互作用的LJ校正项（公式2）。

非键项：

范德华作用：分两类

水相关对：LJ12-4势

其他对：LJ9-6势

静电作用：库仑势（相对介电常数 εr=80)

4.2. 参数优化策略

参数通过多尺度验证优化，目标复现实验和AA MD数据：

4.2.1 键合参数优化

方法：映射AA MD轨迹（CHARMM36力场），拟合键长/键角分布

示例：图S3对比AA与CG的键长（NC2-EST1、EST1-CM1）和键角（EST1-CM1-CM）分布，手动调整 kb,kθ 以匹配峰值和离散度。

4.2.2 非键参数优化

表面张力（γ）匹配

AA参考：模拟二元单层（如MC3/DOPC）

系统：100个MC3 + 100个DOPC，面积/脂质=0.95 nm²，水分子~1800个（表S1）。

收敛验证：图S4显示γ在100 ns内收敛。

CG优化：调整 εij,σij 使CG γ ≈ AA γ（误差<3 mN/m，表2）。

密度剖面匹配：

对比AA与CG的脂质头基沿法线方向分布（如MC3的NC2与DOPC的PH），优化LJ参数（图4）。

DNA-脂质复合物Rg匹配：

AA参考：模拟50个MC3 + 1个dsDNA（12 bp）

结果：中性MC3/DNA的 Rg=24.2±0.2 Å（表S5）。

CG优化：调整NC3-DNA静电参数，使CG Rg误差≤0.4 Å（表S5）。

4.2.3 实验校准

π-A等温线：通过Langmuir槽实验测量MC3单层表面压力，优化CG参数复现曲线（图3）。

4.3. 模拟系统构建

4.3.1 初始配置生成

LNP构建流程（图2）：

核心自组装：随机放置阳离子MC3、胆固醇、dsDNA于小盒子（水体积分数24%），运行CG MD至自组装（400 ns）。

添加外壳：将组装体置于更大盒子，用PACKMOL添加PC脂质（DOPC/DSPC）形成球形外壳，加水至实验浓度。

关键参数：

小LNP：6,400 MC3脂质 + 4,992胆固醇 + 64 dsDNA + ~415,000水粒子（表S2）。

大LNP：51,200 MC3脂质 + 39,936胆固醇 + 512 dsDNA + ~5.15×10⁶水粒子（表S2）。

4.3.2 模拟设置

软件与硬件：

AA MD：GROMACS 5.0.4，PME静电，截断半径1.2 nm。

CG MD：LAMMPS，P3M静电，时间步长5 fs，LJ截断15 Å。

系综控制：

单层系统：NVT系综（固定盒子尺寸）。

LNP系统：NPT系综（Andersen恒压器1 atm，Nosé-Hoover恒温298 K）。

模拟时长：

4.4. 关键分析指标

4.4.1 结构表征指标

概率分布：沿LNP表面法线（r=0至中心）分析脂质/DNA分布（图6），定义：

P(r)=总粒子数粒子数 at r(r: 距SASA表面的向内投影)

径向分布函数（RDF）：量化脂质间相互作用（图11），如DSPC与CHOL的RDF峰值反映结合强度。

4.4.2 动态行为指标

半径回转（Rg）：追踪LNP尺寸变化（图S12）

水合数演化：监测结合水分子数验证系统平衡（图S7-S8）